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作者

Sharla M. Peters¹, Yolanda L. Jones¹, Frank Perrella², Tai Ha³, and Haile F. Yancy¹

 

¹U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. ²U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA. ³Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA.

 

摘要

開發一種實時熒光定量PCR技術檢測豬源肝素鈉粗品中的反芻動物源污染。該檢測法由一套針對反芻動物（牛、綿羊、山羊）和豬的凍干引物、探針及內參組成。該方法經過兩處分析機構驗證：第一個位于FDA，第二個位于某州獨立實驗室。肝素鈉多重實時熒光定量PCR（hMRTA）檢測方法性能通過了美國FDA獸藥中心研發處制定的特異性、靈敏度和專一性嚴格驗收標準。符合早前建立的飼料中反芻動物原料多重實時熒光定量PCR檢測法的靈敏度和重復性要求。hMRTA法檢測豬源肝素鈉粗品， 98%達靈敏度，真陽性98%、假陰性2%。PCR檢測法檢測三個反芻動物物種，可作為判定豬屬來源的初步篩選、復查確認工具。進一步保證肝素鈉粗品質量，幫助識別控制肝素鈉生產來源物種。對粗品肝素鈉的來源控制將保障含肝素鈉藥物和耗材的安全性，保護公眾健康。

 

介紹

肝素鈉粗品質量監控的工業指南 （草案），旨在幫助藥物活性成分、藥品及醫療器械生產廠家更好地控制使用的肝素鈉粗品的質量，防止OSCS或來自反芻動物的污染。要求使用者建立適當的測試方法或使用USP方法來鑒別和控制動物來源的肝素鈉粗品質量。USP專論里已作出規定，肝素鈉應明確標明動物種類及器官組織的來源。要求采購肝素鈉粗品的藥物和醫療器械廠家要對每批肝素鈉粗品在生產或準備生產含肝素鈉藥物或醫療器械前要鑒別其物種來源。

以下測定方法使用了實時熒光定量PCR技術檢測肝素鈉粗品反芻動物污染。用豬源、牛源標準物評估可靠性。識別豬源肝素鈉粗品中的反芻動物DNA。

操作指南提供了方法的具體細節，包括所需試劑、設備。

 

材料及方法

建議每批待測樣品（提取、純化去雜質和PCR）都設立陰性對照。并同時給每批BioGX Ruminant and Porcine Beads設置商業化基因組DNA（牛、豬、山羊、綿羊）陽性對照。

 

1、DNA提取

介紹:

從0.5ml干燥肝素鈉粗品中提取DNA的方法描述如下：請在提取操作開始前通讀整篇標準操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生產的ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的試劑、槍頭和離心管均為DNase free。 槍頭需有氣溶膠抗性（Aerosol resistant），減少從DNA提取到PCR擴增過程中樣品之間的交叉污染。因處理的是粉狀物質，建議步驟1、2帶上口罩，并與DNA提取、純化和PCR地點隔離。

注意：粗品肝素鈉的PCR檢測需在其它會影響DNA完整性的任何前處理（如化學氧化）前進行，以免影響PCR物種檢測結果。

 

1.1. 所需材料：

試劑盒：

ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)

PowerClean® DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)

BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)

 

設備要求:

Micro centrifuge

Heat Block

Nuclease Free Water

Vortex

Invitrogen Magna Rack

2.0 mL Tubes

Smart-Cycler

Smart Cycler centrifuge

Smart Cycler cooling block

SmartCycler 25 µL reaction tubes

 

1.2. 操作步驟

a. 加入混勻的肝素鈉樣品到2ml離心管的0.5ml標記線。

     *關鍵步驟：每次只加一個樣，前一個樣品加樣完成前不能打開下一個離心管。

b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到樣品中。往離心管加入裂解緩沖液時，離心管稍微傾斜。

c. 每樣加入100μl ChargeSwitch SDS。渦旋5s混勻。

d. 95℃孵育（水浴或加熱箱）5min。

e. 每樣加入400μl ChargeSwitch Precipitation Buffer（N5）。渦旋5s混勻。

f. 冰浴離心管5min沉淀蛋白。

g. 室溫16100g離心5min。

h. 轉移1200μl上清液到一個新的離心管中。

i. 渦旋裝有ChargeSwitch Magnetic Beads的離心管，充分重懸浸泡在儲存緩沖液中的磁珠。

j. 加入200μl ChargeSwitch Detergent到含上清液的離心管中。

k. 加入40μl充分重懸的ChargeSwitch Magnetic Beads。

l. 上下吹打5次混勻。

m. 室溫孵育1min。

n. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約

1min）。

o. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時槍頭不要對著沉淀物。

p. 從磁鐵取下離心管。

q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。

r. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約

1min）。

s. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時槍頭不要對著沉淀物。

t. 從磁鐵取下離心管。

u. 加入750μl  ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。

v. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約

1min）。

w. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時槍頭不要對著沉淀物。

x. 加入750μl  ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。

y. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約

1min）。

z. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時槍頭不要對著沉淀物。最后一次

清洗，吸掉所有上清。

aa. 從磁鐵取下離心管，此時管內不應有上清液。

bb. 加入75μl ChargeSwitch Elution Buffer（E5）到離心管。

cc. 輕輕上下吹打10次重懸ChargeSwitch Magnetic Beads。

dd. 室溫孵育1min。

ee. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約

1min）。

ff. 離心管留在磁鐵上，小心轉移含有DNA的上清到一個新的滅菌了的2ml離心管中，勿攪動

沉淀。吸取上清時，槍頭不要對著沉淀。

gg. 棄去用過了的ChargeSwitch Magnetic Beads。

*DNA -20℃冷凍保存或繼續進行DNA純化去雜質

 

2. DNA純化去雜質 

介紹：

下文描述如何去除以上提取的肝素鈉粗品DNA 中PCR抑制因子（如肝素）。在純化去雜質開始前需通讀整篇標準操作流程。本段使用MOBIO（Carlsbad, CA）的PowerClean® DNA Clean-Up Kit。試劑盒提供的所有試劑盒離心管均DNase free。

 

2.1. 操作步驟

a. 加入75μl nuclease free水到DNA樣品中。

b. 加入750μl PowerClean DNA Solution 1到DNA中。上下顛倒3-5次混勻。

c. 加入20μl PowerClean DNA Solution 2，上下顛倒3-5次混勻。 

注意：檢查PowerClean DNA Solution 2，若有沉淀，60℃水浴并輕搖直至沉淀全部溶解。不要劇烈搖晃以免產生大量泡沫。可趁熱使用。

d. 加入85μl PowerClean DNA Solution 3，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。

e. 室溫10000g離心1min。

f. 避開沉淀，轉移所有上清到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

g. 加入70μl PowerClean DNA Solution 4，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。

h. 室溫10000g離心1min。

i. 避開沉淀，把上清轉移到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

j. 搖勻PowerClean DNA Solution 5。加入800μl PowerClean DNA Isolation 5到上清中，渦旋5s

混勻。

k. 加載600μl上清液到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。

l. 棄去濾液，把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上，室溫10000g離心1min。

m. 棄去濾液。加入500μl PowerClean DNA Solution 6到Spin Filer，室溫10000g離心30s。

n. 棄去濾膜。

o. 室溫13000g離心2min。

p. 小心把Spin Filter轉移到一個新的2ml Collection tube（試劑盒提供）中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。

q. 加入75μl PowerClean DNA Solution 7到白色濾膜中心。

r. 室溫10000g離心30s。

s. 棄去Spin Filter。-20℃冷凍保存直至PCR擴增。

 

 3. 實時熒光定量PCR擴增

設計該操作流程/步驟是為使用Cepheid的SmartCycler分析豬源肝素樣品中反芻動物DNA的存在。在其他操作平臺上使用該步驟需要適當的加以調整以驗證這部分是否符合（相對應平臺的）標準程序。

 

3.1. 準備實時檢測

a. 從冰箱中取出裝有樣品制備珠管的可重復用密封袋。從密封區域頂部的缺口
撕開袋子。

b. 從袋中取出所需數量的管子，并輕輕打開每一根管子。

c. 向每管中加入25 µL無核酸水（無核酸污染的水），用槍頭混合后蓋上管蓋。

d. 使用微量離心機將所有管子快速離心5s。

e. 珠子空白對照（珠子+無DNA的水）必須與每一批待測樣品同時檢測。

 

3.2. 步驟

a. 分裝25 µL先前準備好的預混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反應管。

b. 向每一根對應的PCR反應管中加入1 µL樣品。

c. 蓋上管蓋，在SmartCycler離心機中離心5s。

d. 將PCR反應管放入SmartCycler區塊的每一孔中并蓋上各個蓋子。

e. 準備運行程序：

f. 點擊"Create Run"圖標。染料設置選擇FCTC。

g. 選擇操作規程（見3.3部分）。

h. 選擇適當數量的位點（即在運行的PCR管的數量）

i. 給每一個位點標注一個與每管組分相對應的樣品ID。

j. 點擊"Start Run"。

注：陽性結果需要有一個循環閾值（Ct值）。

 

3.3 PCR反應條件

這一操作規程必須在PCR運行開始前加以設定。使用唯一的名稱保存參數。

 

PCR程序：

第一階段：95.0°C 120s（光學元件關閉）

第二階段：45個循環

95.0°C 10s（光學元件關閉）

56.0°C 60s（光學元件開啟）

注：分析時，Ct值應設定成缺省值30

 

4. 結果分析

染料設定為FCTC，用于熒光檢測。反芻動物DNA的陽性結果的判定是一個樣品在FAM通道45個反應循環之前出現Ct值。豬的材料的陽性結果是在TxR通道出現陽性的Ct值。內部擴增控制（IAC）在Cy5通道中報告，有助于降低假陰性報告。許多不同類型肝素樣品含有抑制劑。本試驗包括一個IAC，以確保PCR的條件是合適的，這樣，最大限度地減少由熱啟動酶的抑制造成的假陰性結果報告。具體地講，IAC可以反映樣品中存在PCR抑制因子時報道的陰性結果。引物與探針能結合反應混合物中合成的序列。

當樣品中沒有PCR抑制因子，而靶目標沒有擴增時，IAC應當產生Ct值為32-37之間的信號。如果目標樣品是高濃度，IAC可能會也可能不會報告由于競爭而出現的擴增。這是正常的。

如果IAC在Ct值37處仍未出現，或者在目的擴增中沒有報告（其Ct值），樣品可能含有阻止目的檢測的PCR抑制劑。如果觀察到這一結果，建議將分裝的新的肝素粗品重提并額外純化后使用。

對于反芻動物樣品的陽性結果，應當用PCR對同一DNA樣品額外檢測兩次，即全部三次檢測結果均為陽性的，則確認該樣品為陽性。

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